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    關于流式熒光的技術介紹

    最近涉及流式熒光的公司越發多了起來,相比于化學發光,它確實有自己獨特的優勢,其中最主要的特點就是可以實現1人份試劑的多項目聯合檢測。比如對于自身免疫的項目,化學發光一般都是單孔單檢,流式熒光可以做到單孔多聯檢,也就是相同用量的血清,化學發光只檢測了一個項目,流式熒光卻檢出了幾個甚至幾十個的項目。


    首先介紹一下最關鍵的磁珠。不同類型的磁珠混在一起,儀器是怎么區分開的呢?目前有以下幾種類型:


    1.靠磁珠的大小加以區分。


    流式涉及兩個概念,FSC(前向散射光)和SSC(側向散射光)。從使用經驗來看,顆粒越大的,FSC就越大;內部結構越復雜的,SSC就越大。怎么理解呢?比如對于FSC,磁珠的顆粒越大,磁珠的投影也就越大,對應的光圈也就越大。比如你用激光去照射一粒面粉和一粒大米,大米的外部光圈肯定會更大。對于SSC,我們可以想象一下,你用激光照射一堆透明的玻璃球,和照射一堆內部鑲嵌了小星星的玻璃球,肯定后者的側面散射光信號更強。


    那好了,流式儀器一般會用激光照射并收集FSC和SSC,做二維坐標圖,根據圖像來分別不同的磁珠。但是有一個問題,如果磁珠的制備工藝相似,那么它們的內部結構就類似,導致SSC都普遍接近,最終起到區分作用的只有FSC這個指標。但是我們希望不同項目的磁珠粒徑盡量接近(4-6um),反應才比較均衡,所以僅僅靠FSC和SSC來區分的磁珠,可用性很小。


    2.摻入熒光素。


    有的公司只摻入了一種熒光素,比如蘇州為度新開發的流式磁珠,首先靠FSC區分4um和5um的兩個群體,然后每個群體又摻入了9個梯度的熒光素APC,最終做出了18重磁珠,這是一種開發思路;但是我們上面講到了,磁珠的粒徑最好是一致的,所以像是深圳唯公的磁珠,就摻入了兩種熒光素,也就是磁珠的粒徑都一樣,靠的是兩種熒光素的摻入比例來進行區分,這與luminex的開發思路是一致的,這樣做出來的磁珠種類更多,也更利于免疫檢測。


    然后再講一下反應模式。



    對于自身免疫和過敏原這種抗體檢測項目,一般都是采用的間接法。也就是磁珠標記抗原,檢測抗體為PE(藻紅蛋白)標記的抗人IgM或抗人IgG或抗人IgE等。


    也許有人會問,能不能采用捕獲法呢?標記抗人Ig抗體,然后用不同的蛋白標記PE來進行檢測?這樣是不行的。雖然磁珠仍然可以分開,但是它們都可以抓住不同類型的Ig抗體,可以出現一陽全陽的局面,這顯然是不可行的。


    對于雙抗夾心的項目,同樣是將標記抗體分別標記不同的磁珠,對于檢測抗體,一般有兩種操作:


    一是將各個抗體分別標記PE,然后進行混合;


    二是將各個抗體分別標記Biotin,最終借助SA-PE進行最終的檢測。


    一的難點是抗體與PE的標記,這對于很多公司都是一個技術壁壘,感覺操作容易產生很大的批間差。


    二的特點是生物素標記比較簡單,但是因為借助了SA-PE,所以反應步驟會增加,反應時間會延長,對于反應時間有要求的項目,則需要斟酌一下。


    流式熒光與化學發光在研發上的區別?


    不管是流式磁珠還是發光用的磁珠,目前大部分都還是羧基磁珠,所以在標記工藝方面來說幾乎是一樣的,只不過在數量方面會有較大差別。流式磁珠在使用的時候一般按照個數計量(如1×10^5個/mL),發光磁珠則一般按照重量單位mg/mL進行計量,所以發光的磁珠和抗體消耗是相對較大的。但是我們得相信,量的積累一定會保證質的提升,所以發光試劑在準確度方面一般是優于流式熒光的。


    并且由于流式磁珠是逐個地去測試熒光值,每個磁珠的熒光值難免存在差異,熒光結果的報告也會有不同的形式,可以用平均值,也可以采用中位數,但是這個數據也是會隨著圈圈的大小和位置不斷地變化。


    況且,由于微球反應完成后會出現聚集的情況,反應前和反應后的位置會發生位移,甚至有的出現明顯地分散,導致距離太近的微球難以區分彼此,導致結果的誤判。比如下圖的例子,對于黃色標注的區域,我們很難界定微球的隸屬關系,如果其中一個項目是陰性,一個項目是陽性,圈的位置稍有差池,兩個項目的可能就都報成了陽性。


    2023-9-8
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